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Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
更新時間:2024-06-26
訪問量:1218
廠商性質(zhì):代理商
生產(chǎn)地址:美國
Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒
包裝規(guī)格
產(chǎn)品貨號:An0020、An0050、An0100
規(guī)格:20T、50T、100T
儲存條件
4oC保存,一年有效
產(chǎn)品介紹:
磷脂酰絲氨酸(PS)是一種帶負(fù)電荷的磷脂,正常細(xì)胞中,PS只分布在細(xì)胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側(cè),而在細(xì)胞凋亡早期,細(xì)胞膜 PS由脂膜內(nèi)側(cè)翻向細(xì)胞膜外側(cè),使PS暴露在細(xì)胞膜外表面。Annexin V是一種分子量為35~36kD的Ca2+ 依賴性磷脂結(jié)合蛋白,與磷脂酰絲氨酸有高度親和力,故可通過細(xì)胞外側(cè)暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細(xì)胞的胞膜結(jié) 合。因此Annexin V被*為檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。
Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡檢測試劑盒將Annexin V進(jìn)行綠色熒光(FITC)標(biāo)記,以標(biāo)記了的Annexin V作為探針,利用熒光顯微鏡或流式細(xì)胞儀 可檢測細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(Propidium Iodide, PI)是一種核酸染料,它不能透過正常細(xì)胞或早期凋亡細(xì)胞的完 整的細(xì)胞膜,但對凋亡中晚期的細(xì)胞和壞死細(xì)胞,PI能夠透過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核染紅。因此采用Annexin V與PI雙染的方法,就可以將處于不同凋亡時期的細(xì)胞區(qū)分開來。
圖 1. 細(xì)胞凋亡過程中磷脂酰絲氨酸(PS)外翻示意圖
試劑盒組份:
所需實(shí)驗(yàn)器材:
微量移液器;PBS;不含 EDTA 的胰酶消化液;低速離心機(jī);流式細(xì)胞儀
注意事項(xiàng):
1. 此試劑盒僅供研究使用。
2. 微量試劑需離心數(shù)秒將試劑收集至管底后再開蓋取用。
3. Propidium Iodide(PI)有毒,操作時要帶手套,使用時避免與皮膚,眼睛和黏膜接觸。
4. Annexin V-FITC 中含有毒成分三氮化鈉(NaN3), 操作時要帶手套,使用時避免與皮膚,眼睛和黏膜接觸。
5. 本試劑盒用于檢測活細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測時,細(xì)胞數(shù)量不應(yīng)低于 1x106。
6. 染色后宜盡快檢測,時間過長可能會導(dǎo)致凋亡或壞死細(xì)胞的數(shù)量增加。
7. Annixin V 檢測凋亡細(xì)胞的方法適用于懸浮生長的細(xì)胞,如:淋巴細(xì)胞等細(xì)胞的檢測。對于貼壁生長的細(xì)胞,由于 在胰酶等消化處理過程中會造成細(xì)胞膜的損傷,會造成較高的假陽性,而用細(xì)胞刮子會造成細(xì)胞粘連成團(tuán),而影響 檢測,可將胰酶消化后的細(xì)胞保存在含 2%BSA 的 PBS 中,防止進(jìn)一步的損傷。盡管目前,包括國外也有一些單 位采用該方法檢測貼壁生長的細(xì)胞。我不推薦用該方法檢測。因?yàn)槠渲貜?fù)性較差,且需要操作時非常小心。
8. 消化貼壁細(xì)胞殘留的胰酶會消化并降解 Annexin V-FITC,最終導(dǎo)致染色失敗。
9. 細(xì)胞固定后可能導(dǎo)致熒光的淬滅,請不要固定樣品。
操作說明:
1. 細(xì)胞樣品的準(zhǔn)備:
a) 懸浮細(xì)胞:
1)收集細(xì)胞至離心管中 1000-2000rpm 離心 5min,小心去除上清。
2)用 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
3)再加入 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
b) 貼壁細(xì)胞:
1)吸出細(xì)胞培養(yǎng)液至離心管中,PBS 洗滌貼壁細(xì)胞一次,加入適量不含 EDTA 的胰酶細(xì)胞消化液消化細(xì)胞。
2)室溫孵育至輕輕吹打可以使貼壁細(xì)胞吹打下來時,吸除胰酶細(xì)胞消化液。需避免胰酶的過度消化。
3)加入以上步驟中收集的細(xì)胞培養(yǎng)液,稍混勻,轉(zhuǎn)移到離心管內(nèi),1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。 注:加入的細(xì)胞培養(yǎng)液一方面可以收集已經(jīng)懸浮的發(fā)生凋亡或壞死的細(xì)胞,另一方面細(xì)胞培養(yǎng)液中的血清可 以有效抑制或中和殘留的胰酶;殘留的胰酶會消化并降解后續(xù)加入的 Annexin V-FITC 導(dǎo)致染色失敗。
4)用 1ml 4℃預(yù)冷 PBS 輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù),1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
5)再加入 1ml 4℃預(yù)冷的 PBS 重懸細(xì)胞,1000-2000rpm 離心 5min,小心吸除上清。
2. 用去離子水按 1:4 稀釋 Binding Buffer(4ml Binding Buffer+12ml 去離子水);
3. 用 250?l 結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞,調(diào)節(jié)其濃度為 1×106/ml;
4. 取 100?l 的細(xì)胞懸液于 5 ml 流式管中,加入 5?l Annexin V-FITC,輕輕混勻;
5. 室溫(20-25oC)避光孵育 10min;
6. 上機(jī)前 5min 加入 10?l 碘化丙啶溶液,輕輕混勻;
7. 上機(jī)前在反應(yīng)管中補(bǔ)加 400?l PBS 重懸細(xì)胞, 避光保存,隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀(FACS)檢測, Annexin V-FITC 為綠色熒光,PI 為紅色熒光。
圖 2. 流式細(xì)胞儀檢測早期凋亡細(xì)胞。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,左下象限顯示活細(xì)胞,右下象限為早期凋亡細(xì)胞,右上象限是凋亡晚期細(xì)胞和壞死細(xì)胞